Pesquisa sobre Síndrome de Angelman

A Síndrome de Angelman (S.A) é um distúrbio neurológico que causa retardo mental, alterações do comportamento e algumas características físicas distintivas. Ela foi pela primeira vez relatada em 1965, quando um neurologista britânico, Dr. Harry Angelman, descreveu 3 crianças com este quadro. Até 1987, o interesse por esta doença foi bastante reduzido. Neste ano, observou-se que a análise dos cromossomos de afetados por S.A. mostrava em cerca de 50% dos indivíduos a falta de uma pequena porção (deleção) do cromossomo 15. O que parecia ser uma situação muito rara mostrou-se bastante frequente: estima-se atualmente que uma em cada quinze ou vinte mil crianças são afetadas por esta doença.

O gene responsável pela síndrome de Angelman (SA), UBE3A, é único por ser um dos poucos genes expressos no sistema nervoso central que sofre imprinting, um fenômeno genético onde certos genes são expressos de acordo com sua origem parental. A síndrome de Angelman decorre de uma série de anomalias no cromossomo 15, cada uma delas provocando a perda funcional do gene UBE3A materno.

Nossa pesquisa sugere que o distúrbio cognitivo observado na SA resulta de uma perturbação na sinalização da CaMKII. É importante notar que a αCaMKII só é produzida após o nascimento, o que torna uma intervenção terapêutica possível a princípio. O NLML (Neurobiology of Learning & Memory Laboratory – Laboratório de Neurobiologia do Aprendizado e Memória) explora vários caminhos para reverter as deficiências de memória e aprendizado nos camundongos modelo de SA e colabora com pesquisadores clínicos na elaboração de testes clínicos.

Projetos de pesquisa atuais do NLML

Vamos mostrar abaixo um panorama geral do trabalho que estamos desenvolvendo e das pessoas que são a força motriz das pesquisas. É importante lembrar que, embora possamos relatar o que estamos fazendo de modo geral, muitas vezes certos aspectos dessas pesquisas, ou descobertas novas e emocionantes, precisam ser mantidas confidenciais por um período de tempo, enquanto manuscritos são elaborados para publicação ou os direitos de propriedade intelectual são estabelecidos. Nossa página será atualizada frequentemente para mantê-los a par das últimas pesquisas que estamos realizando, assim como as implicações das pesquisas para nosso conhecimento da SA e como isso pode influenciar futuras intervenções terapêuticas.


A descrição da síndrome de Angelman frequentemente cria a imagem de uma doença especificamente infantil. Entretanto, existem portadores dessa síndrome, ou “Angels”, de todas as idades. Levamos muito a sério a questão se uma potencial intervenção terapêutica poderia ser eficaz em adultos com SA. Essa pergunta é diretamente correlacionada com a síndrome de Angelman ser ou não um distúrbio do desenvolvimento, onde muito dos danos ocorrem no período pré-natal. Ambas as perguntas podem ser respondidas, por diferentes meios, usando um modelo de camundongo para SA.

Por exemplo, podemos induzir uma deleção da cópia materna do gene Ube3a em um camundongo adulto “típico” e avaliar se esse camundongo vai desenvolver os sintomas da SA da mesma maneira que um camundongo que se desenvolveu sem o gene Ube3a. Essa estratégia está disponível pelas técnicas atuais de genética molecular, mas a produção desses camundongos com SA indutível no animal adulto é bastante cara, além de ser difícil produzir assim um camundongo que seja completamente deficiente para o gene materno. Decidimos então usar como método alternativo a transfecção viral; no fundo, substituimos o gene ausente nos neurônios do cérebro de um camundongo modelo SA adulto.

Quais são os resultados desses experimentos?

Jennifer descobriu que muitos dos sintomas observados no camundongo modelo SA são eliminados, incluindo: o déficit cognitivo medido por testes de aprendizado espacial (plataforma submersa) e associativo (condicionamento de medo) e também de memória.

Esses resultados sugerem que pelo menos o déficit cognitivo associado à falta de Ube3a materno pode ser revertido em um camundongo modelo SA adulto. Por extensão, esses dados sugerem que o mesmo pode ser verdade para adultos com SA. Embora a terapia de substituição gênica seja muito invasiva e experimental para ser usada em testes clínicos, esses dados embasam a teoria que um tratamento para adultos é possível e que alguns, se não todos, aspectos da SA aparentam não ser relacionados ao desenvolvimento.

Uma estratégia para o tratamento da SA seria “de-silenciar” o gene Ube3a paterno. Esta é uma idéia extremamente atraente, considerando que a maioria dos casos de SA são devidos à deleção ou mutação do gene materno, enquanto o gene paterno está presente e intacto, mas simplesmente desligado. (Essa capacidade de aumentar a produção paterna do Ube3a está descrita abaixo).

Algumas questões devem ser resolvidas antes que esse tipo de tratamento possa ser avaliado completamente. Por exemplo, será que o gene Ube3a materno permanece estático nos neurônios, e será que há um padrão diferenciado de expressão em regiões específicas do cérebro? Também é preciso entender melhor o silenciamento do gene paterno no sistema nervoso central. Estudos anteriores sugeriram que o gene paterno apresenta um padrão de silenciamento que é diferente em cada região cerebral. Nosso trabalho recente demonstra que esse não é o caso, e que o silenciamento da proteína Ube3a ocorre em todo o cérebro. Além disso, o gene paterno não é completamente silenciado, mas continua a produzir níveis baixos da proteína.

A pesquisa da Irina visa determinar a contribuição da expressão paterna no camundongo modelo SA, quantificar a diferença nos níveis de expressão dos alelos paterno e materno da proteína Ube3a e determinar se há diferenças espaciais ou temporais nessa expressão.

Outra estratégia viável para o tratamento da SA seria resolver os problemas no cérebro que impedem a comunicçao normal entre os neurônios. Isto poderia fornecer uma alternativa terapêutica para os pacientes com diagnóstico clínico de SA sem causa genética (isto é, deleção materna, mutação, dissomia uniparental ou distúrbio de metilação).

Avanços recentes esclareceram muitas alterações moleculares e estruturais (a nível dos neurônios) observadas no camundongo SA. Existrá um tratamento para neutralizar as mudanças associadas à deficiência de Ube3a materno? Acreditamos ter identificado pelo menos uma proteína em potencial, chamada Reelina.

A Reelina é uma proteína que ocorre naturalmente em nosso cérebro e se associa com uma série de receptores que modulam a função sináptica e participam no processo de aprendizado e formação de memória. Um trabalho recente desenvolvido em nosso laboratório mostrou que quando a Reelina é injetada nos cérebros de camundongos “típicos”, eles aprendem mais rápido e têm melhor memória do que os camundongos do grupo controle que receberam injeção de solução salina. Além do mais, a Reelina aparenta aumentar o número de conexões sinápticas potenciais, elevar a função sináptica do hipocampo e aumentar os receptores envolvidos no aprendizado e formação da memória; todos os aspectos que apresentam deficiência nas pessoas com SA.

Raquel injeta Reelina nos cérebros de camundongos SA adultos para determiner se alguns dos sintomas do camundongo SA podem ser revertidos. Se isso ocorrer, trabalharemos para desenvolver um sistema para levar Reelina ao cérebro, ou identificar uma droga que simule o efeito da sinalização da Reelina.

Ashley e Erika conduzem um dos mais interessantes projetos de pesquisa do laboratório. Com uma verba concedida pela Foundation for Angelman Syndrome Therapeutics (FAST – Fundação para Terapia da Síndrome de Angelman) para o NLML, estamos testando drogas conhecidas e disponíveis comercialmente quanto à sua eficácia no tratamento dos defeitos cognitivos, motores e psicológicos no camundongo modelo SA.

Introdução sobre a síndrome de Angelman

A síndrome de Angelman (SA) é um distúrbio neurogenético com sintomas complexos que incluem atraso significativo do desenvolvimento, limitação cognitiva profunda, defeitos de coordenação motora, crises epiléticas com EEG anormal com padrões sugestivos, distúrbios do sono, dificuldades comportamentais, ausência de fala e comportamento alegre. A doença foi descrita pela primeira vez em 1965 pelo pediatra inglês Dr. Harry Angelman. Entretanto, a SA é caracterizada clinicamente por uma vasta gama de sintomas com vários níveis de gravidade e não é rapidamente identificada pela apresentação clínica, sendo que erros no diagnóstico são comuns.

Nos últimos anos, a SA começou a ter uma maior presença na literatura científica e, como resultado, passou a ser mais reconhecida na prática clínica. Como é típico para doenças raras, a pesquisa básica inicial começou com um pequeno grupo de laboratórios. Essa pequena comunidade de médicos e cientistas conseguiu identificar e caracterizar o gene responsável pela doença e depois produziu um modelo animal para examinar as origens moleculares desse complexo de sintomas. Descobertas advindas desses primeiros estudos formaram a base do que conhecemos hoje sobre a SA e estabeleceram o dogma atual sobre sua genética e etiologia. As particularidades moleculares e bioquímicas da SA lentamente ganharam atenção de pesquisadores e, com o envolvimento de mais grupos multidisciplinares, nosso conhecimento da doença continua a crescer e a percepção geral da SA como uma doença do desenvolvimento de uma região específica do cérebro começou a surgir. Estudos publicados recentemente advogam que, embora a origem genética da SA seja simples, o defeito genético resulta em um padrão bioquímico específico bastante complexo, com subsequente variabilidade de expressão.

A prevalência da SA é de 1/10-20.000 nascimentos. A SA pode surgir devido a uma gama de perturbações genéticas em uma pequena região localizada no cromossomo 15 que contém genes sob efeito de imprinting. A informação contida em certos genes dessa região é modificada por padrões de metilação diferencial, dependendo se o gene chegou à criança através do óvulo ou do espermatozóide. Essa modificação é chamada de imprinting genético e determina se a informaçao contida naquela cópia do gene vai ser expressa ou não. O padrão de imprinting do gene UBE3A leva à expressão da cópia materna do gene, enquanto a cópia paterna é silenciada. Cerca de 70% dos casos de SA resultam de uma deleção esporádica de cerca de 4 Mb de material genético do cromossomo 15q11-13 materno, que contém o gene UBE3A (Classe I) (1, 2). Entre 7-9% dos casos de SA resultam de mutações de imprinting, onde tanto o cromossomo materno quanto o paterno sofrem a metilação do DNA no estilo paterno (Classe III), e ambos genes são silenciados (3, 4). Cerca de 2-3% têm dissomia uniparental (DUP), onde o indivíduo herda duas cópias da região do cromossomo 15 paternas, sem a presença de cópias maternas (Classe II) (5, 6). O restante dos indivíduos com SA diagnosticada clinicamente não possuem nenhuma das mutações acima e nenhuma alteração identificada na região 15q11-13.

1. RE Magenis et al., Am J Med Genet 35, 333 (1990).
2. LC Kaplan et al., Am J Med Genet 28, 45 (1987).
3. K Buiting et al., Nat Genet 9, 395 (1995).
4. JM Gabriel et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 9258 (1999).
5. JH Knoll et al., Am J Med Genet 32, 285 (1989).
6. S Malcolm et al., Lancet 337, 694 (1991).

Função do gene UBE3A

O produto gênico do UBE3A foi descoberto ao se estudar o papel do vírus oncogênico HPV (human papilloma virus – vírus papiloma humano) na degradação da proteína de supressão tumoral p53. Estudando-se a expressão do gene E6 do HPV após infecção viral, descobru-se que a proteína HPV E6 precisava estar associada a uma outra proteína para poder degradar a p53 (15-18). Essa proteína associada foi chamada de E6-AP (E6-associated protein, proteína associada a E6). Trata-se de uma proteína de 100 kDa que funciona como uma enzima ubiquitina-quinase, efetuando a degradação da p53 pela via proteosômica. O processo de ubiquitinação envolve vários passos (Figura abaixo). No passo enzimático inicial, a enzima E1 ativa a ubiquitina em uma reação dependente de ATP que liga a E1 à porção C-terminal de uma molécula de ubiquitina. Enzimas conjugantes E2 então aceitam e transferem a porção ativada da molécula de ubiquitina da E1 para uma ligase E3 ou diretamente para o substrato final. A ligase E3 confere especificidade no reconhecimento de substrato para ubiquitinação.

Esse processo é às vezes associado à ligase E4 que irá adicionar um número específico de moléculas de ubiquitina à cadeia até criar um comprimento tal que sinalize o início da degradação proteossômica. A causa primária da SA é a ausência do gene UBE3A, que codifica a E6-AP (19, 20). Na época de sua descoberta, acreditava-se que alvos proteicos específicos da Ube3a estavam se acumulando e, com isso, levando à disfunção sináptica generalizada. Além do mais, esses alvos proteicos no sistema nervoso central humano seriam relativamente fáceis de identificar devido ao fato de que a Ube3a pertence à classe E3 de ubiquitina-ligases, e deveria ter um número limitado de moléculas-alvo. Entretanto, a busca por alvos da Ube3a mostrou-se bastante árdua.

Usando métodos tradicionais para identificação de proteínas ubiquitinadas por meio de eletroforese em gel 2D, algumas proteínas foram identificadas como alvos da Ube3a, incluindo a proteína de supressão tumoral p53, a proteína HHR23A (homóloga humana da proteína de reparo de DNA da levedura Rad23 (21)), e a subunidade 7 da proteína de manutenção presente em várias cópias (Mcm) envolvida na iniciação da replicação do DNA (22). É interessante notar que a E6-AP é um alvo de si mesma, o que sugere uma regulação da concentração de proteína a nivel bioquímico, além do controle sobre a expressão alélica a nível genético através do imprinting (23). O número de alvos foi recentemente expandido e passou a incluir a proteína Arc (24). A proteína Arc é encontrada enriquecida em sinapses e desempenha pelo menos um papel na regulação da expressão de receptores tipo AMPA na superfície da membrana. Portanto, na ausência de Ube3a, a proteína Arc se acumula e reduz o complemento de receptores AMPA na membrana. Essa redução no número de receptores resulta em uma redução nas transmissões sinápticas basais e na diminuição global da função e sensibilidade dos receptores AMPAR.

15. JA Mietz, T. Unger, JM Huibregtse, PM Howley, Embo J 11, 5013 (1992).
16. S. Waddell, JR Jenkins, Oncogene 16, 1759 (1998).
17. JS Park et al., Gynecol Oncol 65, 121 (1997).
18. CC Harris, J Investig Dermatol Symp Proc 1, 115 (1996).
19. JM Huibregtse, M. Scheffner, PM Howley, Embo J 10, 4129 (1991).
20. JM Huibregtse, M. Scheffner, PM Howley, Mol Cell Biol 13, 775 (1993).

Sistemas Modelo da síndrome de Angelman

O camundongo modelo de SA

Dois camundongos modelos distintos foram desenvolvidos usando estratégias diferentes para inativar o gene Ube3a. Na primeira linhagem de camundongos, usou-se a inserção transgênica da proteína latente de membrana 2A do vírus Epstein-Barr (Lmp2a) para remover toda a região equivalente à região crítica da SA (4, 25). Como alternativa, o camundongo modelo desenvolvido por Jiang e colaboradores utilizou um nocaute gênico específico para o gene materno com a inserção de uma mutação nula (26). Enquanto ambos os camundongos modelo têm êxito em inativar a expressão do gene Ube3a materno, existem vantagens e desvantagens nos dois modelos.

A eliminação de múltiplos genes no camundongo modelo com a deleção se parece mais com o que ocorre na maior parte dos pacientes com SA. Entretanto, modelos com nocaute múltiplo de genes são inerentemente mais complexos do que modelos de nocaute de um único gene. Por outro lado, o camundongo modelo com deleção pode não mostrar completamente, ou de maneira precisa, as alterações bioquímicas que resultam na verdadeira manifestação da SA, por causa do efeito combinado de alterações em vários genes. Recentemente foi desenvolvido outro camundongo modelo com uma grande deleção materna que vai do gene Ube3a ao Gabarb3. Essa deleção talvez seja o melhor equivalente à deleção mais comum nos pacientes portadores de SA, cuja deleção remove tanto o UBE3A quanto o GABARB3. Cada um desses modelos apresentam déficits cognitivos, problemas de coordenação motora e tendência a ataques epiléticos.

A despeito das limitações de cada modelo, o camundongo modelo com a mutação nula tornou-se o padrão para a pesquisa da SA, e quase todos os relatos pertinentes usaram esse camundongo modelo específico.

Imprinting genético do Ube3a

Deve-se notar que o camundongo com deficiência de Ube3a materno (m-/p+) também é valioso no estudo dos padrões específicos de imprinting no sistema nervoso central de animais adultos. Isso tornou-se especialmente importante em vista da falta de tecido cerebral de autópsia de pacientes com SA humanos. A identificação de regiões com imprinting pelo uso de técnicas imunohistoquímicas em camundongos é corriqueira e de fácil interpretação. Mais importante, tanto pacientes SA como camundongos com deficiência de Ube3a exibem histopatologia cerebral normal, sugerindo que a deficiência de Ube3a materno não afeta o desenvolvimento ou organização dos neurônios. Em camundongos adultos, um estudo de detecção do mRNA do gene Ube3a revelou alta expressão nas áreas CA1 e CA3 do hipocampo, gânglios basais, cerebelo e por todo o córtex cerebral. Esse padrão foi comparado com o camundongo com deleção materna que não mostra expressão alguma detectável no hipocampo, expressão no cerebelo significativamente reduzida sem detecção alguma na camada de células de purkinje, e uma expressão global reduzida na região olfativa associada com falta de detecção de expressão na camada de células mitrais (25, 26).

Esses resultados in situ estabeleceram o dogma de padrão de expressão regional da proteína Ube3a, onde o mecanismo de imprinting do gene Ube3a cria uma situação específica de ausência de Ube3a em certas regiões encefálicas.

Recentemente, cérebros de um camundongo modelo com deficiência materna de Ube3a foram examinados pela técnica de western blot para detecção da proteína Ube3a. Em oposição ao que havia sido concluído pelo estudo in situ, havia ausência completa de detecção da proteína Ube3a no hipocampo, cerebelo, córtex pré-frontal, corpo estriado e áreas associativas, e o restante do córtex cerebral (27). Esses achados indicam que a deficiência materna de Ube3a resulta na ausência global da proteína Ube3a. Esse experimento, realizado mais de uma década depois da publicação do estudo original de padrão de expressão, levanta uma questão interessante: Porque existe mRNA do gene Ube3a paterno detectável em padrões que são regionalmente distintos, mas não há proteína Ube3a paterna detectável nessas mesmas regiões cerebrais? Não está claro se o mRNA do gene Ube3a paterno serve a algum propósito bioquímico no neurônio por si mesmo, ou se ele pode ser traduzido em uma proteína funcional.

Até o momento, não há evidência in vivo demonstrando aumento da produção da proteína paterna sob quaisquer circunstâncias. De qualquer modo, isso pode explicar por que a deficiência de Ube3a materno leva a sintomas pervasivos e que afetam múltiplos domínios em crianças com SA.

Fenótipos do camundongo modelo SA

A caracterização inicial do camundongo com deficiência de Ube3a materno (que será referido daqui para adiante como Ube3a m-/p+) revelou semelhanças significativas com o fenótipo humano (26). Essas similaridades fenotípicas são mais facilmente notadas quando subdivididas em categorias de características físicas, fisiológicas e comportamentais.

Semelhanças físicas: Deficiências na coordenação motora são comuns na SA. A função e coordenação motora no camundongo modelo foram avaliadas através do teste de impressão da patra traseira, do teste de andar na barra e do teste de aceleração no rotor cilíndrico (rotorod). Cada um desses testes confirmou um díficit distinto e significativo nos camundongos Ube3a m-/p+, que refletem o tremor, a ataxia e dificuldades de coordenação motora descritas nos pacientes portadores da SA. Além disso, camundongos com deficiência materna de Ube3a mostraram um defeito cerebelar característico ao beber água (licking behavior) (28).

Ataques epilépticos são comuns em pacientes com SA, afetando cerca de 90% dos pacientes diagnosticados. Do mesmo modo, ataques epilépticos podem ser facilmente induzidos em camundongos Ube3a m-/p+ por meios audiogênicos, raspando-se um objeto vigorosamente sobre as barras de metal da gaiola do animal ou com a geração de ruído de fundo acima de 100 dB (26).

 

Figura 1 (acima): Teste de aceleração no rotor cilíndrico. Esse teste avalia tanto a coordenação motora como a capacidade de aprendizado motor. O cilindro é girado com aceleração de 4 a 40 rpm por um período de 3 minutos. Mediu-se o tempo decorrido até a queda do cilindro durante um protocolo de 2 dias, com 4 testes diários.

Fenótipos fisiológicos: Naturamente, alterações físicas são mais fáceis de quantificar e tendem a ser um argumento mais convincente para a reprodução da síndrome humana no “modelo animal”. Entretanto, existem várias maneiras de avaliar o comportamento relacionado às habilidades cognitivas humanas no camundongo medindo-se a função sináptica com técnicas eletrofisiológicas. A avaliação da plasticidade das sinápses na área CA1 do hipocampo mostrou um defeito grave na potenciação de longo termo (LTP) induzida por estimulação de alta frequência (hfs), usando um protocolo padrão de 2 treinos e 100 Hz de estímulo. O aumento do número de treinos hfs pode produzir potenciação de magnitude significativamente maior e mais duradoura. Para testar a possibilidade que os defeitos em LTP nos camundongos Ube3a m-/p+ eram devidos a um aumento no limiar da indução LTP, a potenciação foi induzida com saturação do estímulo hfs (6 treinos a 100 Hz), desenhado para provocar o maior grau de potenciação.

Esse protocolo hfs gerou uma resposta LTP no camundongo Ube3a m-/p+ da mesma magnitude vista nos camundongos controle, sugerindo que a potenciação de longo termo na área CA1 era possível quano o limiar era ultrapassado. Esas observações se encaixam em um modelo onde a falta de Ube3a leva à disfunção da proteína Arc, que por sua vez desregula os receptores AMPA, fundamentais para a ativação sináptica (Figuras 2 e 3).

Semelhanças cognitivas: Para estimar a habilidade cognitiva global, avaliaram-se o aprendizado associativo e o uso da memória (através do teste de condicionamento por medo) e a memória espacial (através do teste da plataforma submersa). Para se estudar o aprendizado associativo usando o paradigma do condicionamento por medo, um estímulo adverso (estímilo não-condicionado, ENC) consistindo em um leve choque na pata é pareado, geralmente duas vezes, com um componente auditivo (estímulo condicionado, EC).

O animal é então testado 24 horas após o treinamento pela reintrodução do camundongo na câmara de teste ou colocando o camundongo em um novo contexto, e então repetindo o EC. Aprendizado e memória são checados pela observação do comportamento de “estátua” (freezing behavior), que é um comportamento que denota medo em resposta à associação ao EC ou ao contexto. Embora tanto o aprendizado contextual como o condicional sejam dependentes do funcionamento apropriado da amígdala, apenas o aprendizado contextual depende do hipocampo. O camundongo mutante Ube3a m-/p+ mostrou aprendizado associativo normal em relação ao EC, mas um defeito significativo no condicionamento ao medo contextual.

Alterações no aprendizado espacial não foram tão diretamente identificáveis. Usando um protocolo de treinamento espaçado, camundongos Ube3a m-/p+ demonstraram uma diminuição no tempo decorrido até encontrar a plataforma submersa a cada dia de treinamento, observação similar aos camundongos normais. Entretanto, testes de sondagem mostram um decréscimo significativo no número de cruzamentos pelo local onde se encontrava a plataforma e no tempo passado no quadrante alvo. Isso sugere que camundongos Ube3a m-/p+ desenvolvem uma estratégia de busca que não é tão eficiente quanto a dos camundongos normais.

Figura 2 (acima): Teste da plataforma submersa. O aprendizado espacial foi avaliado pelo teste da plataforma submersa. Nesse teste, os camundongos usam identificadores visuais localizadas fora da piscina onde o camundongo é treinado para nadar até encontrar a plataforma submersa com auxílio desses identificadores visuais externos.

O tempo decorrido até encontrar a plataforma é um indicador de capacidade de aprendizagem. A retenção da memória pode ser determinada com um teste de sondagem, onde a plataforma é removida e mede-se quanto tempo o camundongo passa no quadrante certo (alvo) ou o número de vezes que ele cruza pelo local onde estava a plataforma.

Figura 3 (abaixo): Caminhos representativos gravados durante um teste de sondagem para um camundongo selvagem e um camundongo modelo da síndrome de Angelman. O camundongo modelo da síndrome de Angelman tem tendência a nadar em grandes círculos, indicando a falta de uma estratégia eficiente de busca e redução do tempo passado no quadrante certo.

4. JM Gabriel et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 9258 (1999).
25. U. Albrecht et al., Nat Genet 17, 75 (1997).
26. YH Jiang et al., Neuron 21, 799 (1998).
27. RM Gustin et al., Neurobiol Dis 39, 283 (Sep).
28. DH Heck, Y. Zhao, S. Roy, et al., Hum Mol Genet 17, 2181 (Jul 15, 2008).

Alterações moleculares no camundongo SA

Uma das primeiras alterações moleculares no camundongo Ube3a m-/p+ a ser identificada foi a alteração nos níveis de fosforilação da quinase dependente de cálcio/calmodulina tipo 2 (CaMKII). Análises mostram aumento da fosforilção nos sítios autofosforilantes Treonina 286 (Thr286) e Treonina 305 (Thr305). Isso corresponde a uma redução significativa na sensibilidade ao cálcio-calmodulina, na atividade basal da CaMKII e uma diminuição de CaMKII associada à densidade sináptica (31).

Essa observação foi de particular interesse em vista às extensas pesquisas demonstrando que uma alteração na atividade da CaMKII tem efeitos profundos na plasticidade sináptica e na formação da memória permanente (32, 33). Especificamente, mutações sítio-dirigidas que substituem os aminoácidos Thr286 ou Thr305 por aspartato, que simula fosforilação persistente, produzem efeitos devastadores na formação da memória (33-35).

Figuras 4/5 (abaixo): Bioquímica sináptica selvagem e na síndrome de Angelman. Na sinapse normal, a proteína Ube3a materna aciona outras proteínas, como Arc, para degradação. A relação causal entre Ube3a e CaMKII é desconhecida. Entretanto, a presença da Ube3a mantém a atividade fosfatase e a CaMKII é mantida em um estado receptivo ao influxo de cálcio que se segue à ativação sináptica. Na síndrome de Angelman há aumento da proteína Arc, que por sua vez diminui a inserção de AMAPR na membrana. Além disso, CaMKII encontra-se hiperfosforilada no sítio auto-inibidor, o que reduz a atividade basal da CaMKII e reduz a ativação induzida por cálcio-calmodulina.

Bioquímica em um camundongo selvagem

A identificação das alterações funcionais e bioquímicas no camundongo modelo geraram uma questão óbvia: quanto do fenótipo Ube3a m-/p+ é decorrente da fosforilação alterada da CaMKII? Devido ao grave efeito deletério da fosforilação da CaMKII Thr305 em sua atividade enzimática, e também às semelhanças de fenótipo entre os camundongos CaMKII Thr305-para-Asp305 e os camundongos SA, sugeriu-se que o sítio Thr305 seja o responsável pela maior parte dos sintomas do camundongo Ube3a m-/p+.

Estudos conduzidos nos laboratórios de Weeber e Elgersma utilizaram fêmeas de camundongos SA cruzados com machos aCaMKII heterozigotos para a mutação dirigida aCaMKII-Thr305-para-Val305. O aminoácido valina não pode ser fosforilado e assim impede o acúmulo de Thr305CaMKII fosforilado (CaMKII inativa) nos neurônios. Mais importante, o uso de heterozigotos com essa mutação de ponto reduziu mas não anulou completamente a fosforilação inibidora. Curiosamente, camundongos portadoreas das duas mutações, em CaMKII e em Ube3a, mostraram reversão da maioria dos fenótipos observados nos camundongos SA. Esses estudos confirmam a contribuição da CaMKII alterada no fenótipo dos camundongos com deficiência materna de Ube3a e sugeriram que a disfunção de CaMKII pode ser o defeito molecular primário na SA humana.

Esse trabalho foi publicado e encontra-se disponível na Nature Neuroscience.

31. EJ Weeber et al., J Neurosci 23, 2634 (Apr 1, 2003).
32. AJ Silva, R. Paylor, JM Wehner, S. Tonegawa, Science 257, 206 (Jul 10, 1992).
33. ME Bach, RD Hawkins, M. Osman, et al., Cell 81, 905 (Jun 16, 1995).
34. KP Giese, NB Fedorov, RK Filipkowski, AJ Silva, Science 279, 870 (Feb 6, 1998).
35. R. Bejar, R. Yasuda, H. Krugers, K. Hood, M. Mayford, J Neurosci 22, 5719 (Jul 1, 2002).

http://www.nature.com/neuro/journal/v10/n3/full/nn1845.html

Tenho estado interessado na síndrome de Angelman por mais de 10 anos. Isso começou durante meu pós-doutorado no laboratório do Dr. David Sweatt, no Baylor College of Medicine em Houston, Texas. Seu laboratório era um dos primeiros no país a empregar uma abordagem multidisciplinar (comportamento, eletrofisiologia, bioquímica, biologia molecular, etc.) para melhor compreender os mecanismos moleculares do aprendizado e da memória.

Esse laboratório era vizinho ao laboratório do Dr. Arthur Beaudet, pioneiro na pesquisa sobre a síndrome de Angelman que teve um papel fundamental na descoberta do loco da SA e no desenvolvimento do camundongo modela que usamos até hoje.

O Dr. Sweatt e eu estávamos interessados em como um gene que codifica uma proteína de manutenção homeostática (“house-keeping”) poderia gerar uma doença humana que afeta profundamente o processo cognitivo. O trabalho que eu desenvolvi no laboratório do Dr. Sweatt levou à identificação da alteração no estado de atividade de um enzima importante, chamada CaMKII (Cálcio Calmodulina Proteína Quinase II). O Dr. Beaudet, tendo uma natureza generosa e colaboradora, permitiu que eu levasse o camundongo modelo SA comigo para a Universidade Vanderbilt quando inaugurei meu próprio laboratório em 2004.

Desde então, temos lentamente expandido nosso programa de pesquisa e estamos atualmente focados em várias áreas específicas na pesquisa da SA:

1. Avaliar a eficácia de um tratamento da SA em adultos.

2. Entender os mecanismos que controlam a expressão paterna do gene Ube3a.

3. Identificar possíveis terapias que amenizem a deficiência materna de Ube3a.

4. Avaliar drogas/terapias disponíveis no tratamento da SA.

5. Identificar novas drogas/terapias capazes de ativar o gene Ube3a paterno”

Tradução :.Alessandra Splendore ,pHD